Phương pháp xét nghiệm E. coli trong nước thải
Các xét nghiệm E. coli trong nước thải gồm hai phương pháp là lọc màng (MF, số vi khuẩn/100mL) và lên men ống nghiệm nhân đôi (MTF, số MPN/100 mL). Phương pháp MF bao gồm sử dụng môi trường nuôi cấy cải tiến m-TEC, do EPA phát triển và m-ColiBlue24®, do Hach phát triển. Xét nghiệm MTF (Tiêu chuẩn 9223B và AOAC 991.15) là các phương pháp tiêu chuẩn nhất trí tự nguyện (Voluntary Consensus Standards - VCS). VCS được các thành viên VCS chấp nhận và phát triển. Cả hai phương pháp MF và MTF đều đã có sản phẩm thương mại là các môi trường nuôi cấy được chuẩn bị sẵn để sử dụng tức thì.
m-TEC cải tiến là quy trình một bước đơn giản của phương pháp MF kết hợp một thể nhiễm sắc đặc biệt để phát hiện và đếm số lượng E. coli. Trong phép phân tích này, mẫu nước thải được lọc qua giấy lọc 0.45μm và đặt lên agar m-TEC cải tiến, ủ ở nhiệt độ 35 ± 0.5 oC trong 2 giờ và sau đó được ủ thêm 23 ± 1 giờ trong bể nước có nhiệt độ 44.5 ± 0.2 oC. Ngay sau khi ủ xong, các khuẩn lạc màu đỏ hoặc đỏ tươi xuất hiện chính là E.coli. m-ColiBlue24 là quy trình một bước MF kết hợp với chất ức chế các vi khuẩn không thuộc coliform và có gen chỉ thị chọn lọc cho phép phát hiện và đếm đồng thời E. coli và tổng coliform. Mẫu sau khi được lọc qua giấy lọc 0.45 μm sẽ được đặt vào đĩa petri có chứa miếng lọc và chất dinh dưỡng m-ColiBlue24. Sau đó đem ủ ở 35oC ± 0.5oC trong 24 giờ. Các khuẩn lạc màu xanh xuất hiện sẽ là E. coli và màu đỏ là các coliform khác. Tổng coliforms sẽ là tổng số màu đỏ và xanh xuất hiện. Quy trình phân tích theo MTF có chứa chất nhiễm sắc OPNG giúp phát hiện đồng thời E. coli và tổng coliforms. Mẫu nước sau khi đưa vào các ống nghiệm đã chứa sẵn môi trường nuôi cấy sẽ được pha trộn đều và sau đó đổ ra khay dùng để ủ ở 35oC ± 0.5oC trong 24 giờ. Nếu phát hiện còn nghi ngờ thì sau khoảng thời gian ủ nhất định sẽ được để ủ thêm 4 giờ với cùng nhiệt độ. Sau khi ủ, mỗi ống hoặc khe được so sánh màu với bảng màu tham khảo được cung cấp kèm với môi trường cấy. Nếu mẫu có màu vàng đậm hơn hay bằng với màu tham chiếu thì sự hiện diện của tổng coliforms là rõ ràng. Khi đó mẫu sẽ được kiểm tra sự hiện diện của huỳnh quang. Nếu ánh sáng huỳnh quang sáng hơn hay bằng với mẫu tham chiếu thì mẫu có giá trị dương với test E.coli. Nồng độ MPN/100 mL được tính từ số ống dương tính tương ứng trong bảng giá trị MPN cung cấp từ nhà sản xuất.
Các phương pháp xét nghiệm Enterococci trong nước thải
Các phương pháp xác định và đếm số lượng enterococci trong nước thải gồm có MF và MTF. Phương pháp MF agar mEI được phát triển bởi EPA, môi trường nuôi cấy này có chứa chất nhiễm sắc đặc biệt để phát hiện enterococci. Mẫu nước sau khi lọc sẽ được cho vào agar mEI và ủ ở nhiệt độ 41 ± 0.5 oC trong 24 giờ. Sau khi ủ, tất cả khuẩn lạc có vầng sáng màu xanh và đường kính nhỏ hơn 0.5 mm chính là enterococci. Phương pháp MTF, là phương pháp chuẩn VCS phát triển bởi ASTM sử dụng môi trường MUG. Các mẫu được ủ ở nhiệt độ 41 ± 0.5 oC trong 24 giờ. Sau khi ủ, nếu xuất hiện các huỳnh quang trắng/xanh thì đó là enterococci. Nồng độ
MPN/100 mL là số ống dương tính theo bảng giá trị như phân tích E. coli theo phương pháp MTF ở trên. Cả hai loại môi trường nuôi cấy đều có sẵn trên thị trường.
Phương pháp xét nghiệm Fecal Coliform trong bùn thải
Các phương pháp xác định và đếm số lượng fecal coliforms trong bùn thải gồm có hai phương pháp MF (LT-EC media và A-1 media) được phát triển bởi EPA. Phương pháp phân tích theo LT-EC thì gồm hai bước. Bước thứ nhất sử dụng các ống nghiệm có chứa chất dinh dưỡng LTB được cấy với bùn thải và ủ trong 24 ± 2 giờ ở 35 ± 0.5 oC. Sau khi ủ, sự xuất hiện độ đục và các khí được tạo thành có thể là dương tính với coliform. Nếu độ đục và khí không tạo thành ở lần ủ thứ hai cùng điều kiện nhiệt độ và thời gian thì có nghĩa là không tồn tại fecal coliforms trong mẫu bùn. Phương pháp xét nghiệm dùng môi trường A-1 thì yêu cầu cấy mẫu và ủ trong ống nghiệm ở 35 ± 0.5 oC trong 3 giờ, sau đó ủ thêm 21 ± 2 giờ.Độ đục và khí tạo thành chỉ thị sự hiện diện của fecal coliforms.
Phương pháp xét nghiệm Salmonella trong bùn thải
Phương pháp xét nghiệm Salmonella trong bùn thải bao gồm nhiều bước MTF được phát triển bởi EPA. Trong bước phân lập, các ống nghiệm chứa TSB được cấy với mẫu và ủ ở 36 ± 1.5 oC trong 24 ± 2 giờ. Sau khi ủ, lấy từng giọt trong mỗi ống TSB chấm lên agar Rappaport-Vassiliadis chọn lọc (MSRV). Những giọt này được để hấp thụ vào agar trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem ủ 42 ± 0.5 oC từ 16 đến 18 giờ. Sau khi ủ, các vòng sáng hơi trắng xuất hiện từ mỗi mẫu được chiết ra cho vào đĩa chứa môi trường XLD và được ủ từ 18 đến 24 giờ ở 36 ± 1.5 oC. Sau đó, một trong các đĩa được đem đi xác nhận. Các đĩa còn lại được trữ lạnh để tham chiếu. Sự xuất hiện của các khuẩn lạc màu đỏ hồng với chấm đen ở giữa được cho là Salmonella. Ở bước xác định, các khuẩn lạc hồng đến đỏ được lấy ra và cấy vào môi trường xiên TSI, LIA và urease broth. Tất cả đem ủ trong 24 ± 2 giờ tại 36 ± 1.5 oC. Bước này để xác nhận mẫu dương tính hay âm tính phụ thuộc vào phản ứng màu đặc biệt. TSI là bước tiếp xác nhận bổ sung sử dụng polyvalent O antiserum. Để ống TSB nguyên bản được cho là dương tính Salmonella thì ủ với MSRV, XLD, TSI hay LIA và polyvalent O phải dương tính và urease thì âm tính. Bất cứ xét nghiệm tại phân tích nào bị thất bại thì cho ra kết quả âm tính.
Các xét nghiệm E. coli trong nước thải gồm hai phương pháp là lọc màng (MF, số vi khuẩn/100mL) và lên men ống nghiệm nhân đôi (MTF, số MPN/100 mL). Phương pháp MF bao gồm sử dụng môi trường nuôi cấy cải tiến m-TEC, do EPA phát triển và m-ColiBlue24®, do Hach phát triển. Xét nghiệm MTF (Tiêu chuẩn 9223B và AOAC 991.15) là các phương pháp tiêu chuẩn nhất trí tự nguyện (Voluntary Consensus Standards - VCS). VCS được các thành viên VCS chấp nhận và phát triển. Cả hai phương pháp MF và MTF đều đã có sản phẩm thương mại là các môi trường nuôi cấy được chuẩn bị sẵn để sử dụng tức thì.
m-TEC cải tiến là quy trình một bước đơn giản của phương pháp MF kết hợp một thể nhiễm sắc đặc biệt để phát hiện và đếm số lượng E. coli. Trong phép phân tích này, mẫu nước thải được lọc qua giấy lọc 0.45μm và đặt lên agar m-TEC cải tiến, ủ ở nhiệt độ 35 ± 0.5 oC trong 2 giờ và sau đó được ủ thêm 23 ± 1 giờ trong bể nước có nhiệt độ 44.5 ± 0.2 oC. Ngay sau khi ủ xong, các khuẩn lạc màu đỏ hoặc đỏ tươi xuất hiện chính là E.coli. m-ColiBlue24 là quy trình một bước MF kết hợp với chất ức chế các vi khuẩn không thuộc coliform và có gen chỉ thị chọn lọc cho phép phát hiện và đếm đồng thời E. coli và tổng coliform. Mẫu sau khi được lọc qua giấy lọc 0.45 μm sẽ được đặt vào đĩa petri có chứa miếng lọc và chất dinh dưỡng m-ColiBlue24. Sau đó đem ủ ở 35oC ± 0.5oC trong 24 giờ. Các khuẩn lạc màu xanh xuất hiện sẽ là E. coli và màu đỏ là các coliform khác. Tổng coliforms sẽ là tổng số màu đỏ và xanh xuất hiện. Quy trình phân tích theo MTF có chứa chất nhiễm sắc OPNG giúp phát hiện đồng thời E. coli và tổng coliforms. Mẫu nước sau khi đưa vào các ống nghiệm đã chứa sẵn môi trường nuôi cấy sẽ được pha trộn đều và sau đó đổ ra khay dùng để ủ ở 35oC ± 0.5oC trong 24 giờ. Nếu phát hiện còn nghi ngờ thì sau khoảng thời gian ủ nhất định sẽ được để ủ thêm 4 giờ với cùng nhiệt độ. Sau khi ủ, mỗi ống hoặc khe được so sánh màu với bảng màu tham khảo được cung cấp kèm với môi trường cấy. Nếu mẫu có màu vàng đậm hơn hay bằng với màu tham chiếu thì sự hiện diện của tổng coliforms là rõ ràng. Khi đó mẫu sẽ được kiểm tra sự hiện diện của huỳnh quang. Nếu ánh sáng huỳnh quang sáng hơn hay bằng với mẫu tham chiếu thì mẫu có giá trị dương với test E.coli. Nồng độ MPN/100 mL được tính từ số ống dương tính tương ứng trong bảng giá trị MPN cung cấp từ nhà sản xuất.
Các phương pháp xét nghiệm Enterococci trong nước thải
Các phương pháp xác định và đếm số lượng enterococci trong nước thải gồm có MF và MTF. Phương pháp MF agar mEI được phát triển bởi EPA, môi trường nuôi cấy này có chứa chất nhiễm sắc đặc biệt để phát hiện enterococci. Mẫu nước sau khi lọc sẽ được cho vào agar mEI và ủ ở nhiệt độ 41 ± 0.5 oC trong 24 giờ. Sau khi ủ, tất cả khuẩn lạc có vầng sáng màu xanh và đường kính nhỏ hơn 0.5 mm chính là enterococci. Phương pháp MTF, là phương pháp chuẩn VCS phát triển bởi ASTM sử dụng môi trường MUG. Các mẫu được ủ ở nhiệt độ 41 ± 0.5 oC trong 24 giờ. Sau khi ủ, nếu xuất hiện các huỳnh quang trắng/xanh thì đó là enterococci. Nồng độ
MPN/100 mL là số ống dương tính theo bảng giá trị như phân tích E. coli theo phương pháp MTF ở trên. Cả hai loại môi trường nuôi cấy đều có sẵn trên thị trường.
Phương pháp xét nghiệm Fecal Coliform trong bùn thải
Các phương pháp xác định và đếm số lượng fecal coliforms trong bùn thải gồm có hai phương pháp MF (LT-EC media và A-1 media) được phát triển bởi EPA. Phương pháp phân tích theo LT-EC thì gồm hai bước. Bước thứ nhất sử dụng các ống nghiệm có chứa chất dinh dưỡng LTB được cấy với bùn thải và ủ trong 24 ± 2 giờ ở 35 ± 0.5 oC. Sau khi ủ, sự xuất hiện độ đục và các khí được tạo thành có thể là dương tính với coliform. Nếu độ đục và khí không tạo thành ở lần ủ thứ hai cùng điều kiện nhiệt độ và thời gian thì có nghĩa là không tồn tại fecal coliforms trong mẫu bùn. Phương pháp xét nghiệm dùng môi trường A-1 thì yêu cầu cấy mẫu và ủ trong ống nghiệm ở 35 ± 0.5 oC trong 3 giờ, sau đó ủ thêm 21 ± 2 giờ.Độ đục và khí tạo thành chỉ thị sự hiện diện của fecal coliforms.
Phương pháp xét nghiệm Salmonella trong bùn thải
Phương pháp xét nghiệm Salmonella trong bùn thải bao gồm nhiều bước MTF được phát triển bởi EPA. Trong bước phân lập, các ống nghiệm chứa TSB được cấy với mẫu và ủ ở 36 ± 1.5 oC trong 24 ± 2 giờ. Sau khi ủ, lấy từng giọt trong mỗi ống TSB chấm lên agar Rappaport-Vassiliadis chọn lọc (MSRV). Những giọt này được để hấp thụ vào agar trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng sau đó đem ủ 42 ± 0.5 oC từ 16 đến 18 giờ. Sau khi ủ, các vòng sáng hơi trắng xuất hiện từ mỗi mẫu được chiết ra cho vào đĩa chứa môi trường XLD và được ủ từ 18 đến 24 giờ ở 36 ± 1.5 oC. Sau đó, một trong các đĩa được đem đi xác nhận. Các đĩa còn lại được trữ lạnh để tham chiếu. Sự xuất hiện của các khuẩn lạc màu đỏ hồng với chấm đen ở giữa được cho là Salmonella. Ở bước xác định, các khuẩn lạc hồng đến đỏ được lấy ra và cấy vào môi trường xiên TSI, LIA và urease broth. Tất cả đem ủ trong 24 ± 2 giờ tại 36 ± 1.5 oC. Bước này để xác nhận mẫu dương tính hay âm tính phụ thuộc vào phản ứng màu đặc biệt. TSI là bước tiếp xác nhận bổ sung sử dụng polyvalent O antiserum. Để ống TSB nguyên bản được cho là dương tính Salmonella thì ủ với MSRV, XLD, TSI hay LIA và polyvalent O phải dương tính và urease thì âm tính. Bất cứ xét nghiệm tại phân tích nào bị thất bại thì cho ra kết quả âm tính.
Theo tác giả: Robbin Crane, Cary B. Jackson, Ph.D., Roger Sedlacek và Derek Walker
Hach Company, Loveland, Colorado, USA
Các phương pháp đã được kiểm chứng bởi US-EPS. Theo đó, thì cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (US-EPA) đã điều chỉnh “hướng dẫn thiết lập quy trình thí nghiệm cho việc phân tích các chất ô nhiễm” theo 304 luật nước sạch (CWA) bằng việc bổ sung thêm quy trình phân tích mới cho phương pháp đếm số lượng Esherichia coli (E. coli) và enterococci trong nước thải, và fecal coliforms với Salmonella trong bùn. Các phương pháp bổ sung này đòi hỏi tồn tại cùng với quy định theo hệ thống hạn chế xả thải ô nhiễm quốc gia (NPDES) cho phép để bắt đầu quan trắc E. coli và enterococci trong nước thải và fecal coliforms và Salmonella trong bùn thải trong vòng 30 ngày kể từ khi luật cuối cùng được ban hành trong Sổ đăng kí liên bang (Federal Register-FR).Tháng 8 năm 2005 và tháng 4 năm 2006, EPA soạn thảo để hướng dẫn cho công chúng (70 FR 48256 và 71 FR 18329) để điều chỉnh quy định 40 CFR phần 136 chứng nhận 4 phương pháp E. coli và 2 phương pháp enterococci cho quan trắc ô nhiễm sinh học trong nước thải và 2 phương pháp fecal coliform với 1 phương pháp Salmonella cho quan trắc ô nhiễm sinh học trong bùn. Ngày 29 tháng 9 năm 2006, EPA xuất bản bản thảo Final Rule những phương pháp nước thải mới này. Công bố chính thức và xuất bản trong Sổ đăng kí liên bang vào năm 2007.
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét